细菌单线态氧检测试剂盒-红色荧光

BB-461162
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产品概述 product description

贝博® BBoxiProbe® 细菌单线态氧（1O2）检测试剂盒是一种利用荧光探针BBoxiProbe® O69进行单线态氧检测的试剂盒。O69可以自由穿过细菌胞膜，进入胞内后，在单线态氧存在的条件下，O69探针被氧化生成荧光物质O69F，O69F的红色荧光强度与胞内单线态氧水平成正比，检测O69F红色荧光强度就可以知道细胞内单线态氧的水平。
在激发波长640 nm，发射波长670 nm附近，使用荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜等检测O69F 荧光强度，从而测定细胞内单线态氧水平。
贝博® BBoxiProbe® O69荧光探针对单线态氧（1O2）有较高的选择性，但是也会与活性羟基有反应。
单线态氧（1O2，Singlet oxygen）是活性氧家族的一员，活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括过氧化氢（H2O2，Hydrogen peroxide）、羟基自由基（•OH，Hydroxyl radical）、单线态氧（1O2，Singlet oxygen）、一氧化氮（NO，Nitric oxide）、超氧阴离子(•O2-，Superoxide anion)、过氧化自由基(ROO• ，Peroxyl radical)、过氧羟自由基（HOO• ，hydroperoxyl）及其下游产物过氧化物单线态氧（1O2，Peroxynitrite anion）、ClO-和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。
活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生主要是氧化磷酸化的结果，在呼吸链中，在某些位点会有“泄露”的电子直接和氧气或和其他电子受体反应，在酶或非酶作用下引发一系列反应生成不同种类的活性氧：“泄露”的电子最初和氧气反应生成超氧阴离子自由基(O2·-)(图1A)。超氧阴离子遇水生成H2O2(图1B)，同时过氧化氢也可由氧气在单胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)的作用下生成(图1C)，生成的过氧化氢在髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的催化下与Cl-反应可生成ClO-(图1D)，在铁或铜离子的催化下发生Fenton反应生成OH·(图1E)，超氧阴离子遇氮氧化物反应生成ONOO-(图1F)。这些生成的高氧化活性的物质统称为活性氧。
本试剂盒可以用于各种革兰氏阳性和阴性细菌样本的检测。
BBoxiProbe® O系列活性氧探针具有多种颜色可以选择，可根据情况对样品进行多色标记实验。除了本试剂盒的红色荧光探针，贝博® 还可以提供绿色、蓝色、深红色荧光的活性氧检测试剂盒。

保存温度
-20℃避光保存
注意事项
1. 长期不用-20℃保存。
2. 避免反复冻融。
3. 可以根据需要分装后冻存。
4. 染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
5. 可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
6. 试剂拆封后请尽快使用完！
有效期
6个月
检测方法
1. 荧光酶标仪
2. 荧光分光光度计
3. 流式细胞仪
4. 荧光显微镜
5. 激光共聚焦
适用样本
1. 悬浮细胞
2. 贴壁细胞
产品特点
1. 使用方便：可用荧光分光光度计、荧光酶标仪、激光共聚焦显微镜直接观察或流式细胞仪检测；
2. 背景低，灵敏度高；
3. 线性范围宽，使用方便。
仪器准备
1. 激光共聚焦显微镜或荧光分光光度计或酶标仪或流式细胞仪，
激发波长640 nm，发射波长670 nm。
2. 离心机
3. 移液器
4. 冰箱
5. 冰盒
试剂准备
1. PBS缓冲液
HBSS
耗材准备
1. 离心管
2. 吸头
3. 一次性手套
4. 黑色96孔板
使用注意事项
1. 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
2. 荧光探针标记后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
3. 探针标记完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的标记情况是否正常。
4. 尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。
5. O69染色液为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
6. 使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。
7. 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
8. 标记的条件因细胞种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细胞类型、细胞的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。以下方法仅供参考。
9. 染色后立即进行分析。
10. 以下步骤仅做为参考，稀释比例和孵育时间可根据实际情况来调整。比如，对于某些细胞，如果发现未被刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可降低探针浓度。如果发现用感兴趣的药物刺激后荧光较弱，可升高O69探针浓度，以提高检测的灵敏度。另外，探针装载的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整，孵育温度在4℃-37℃内调整。
11. 酶标仪检测必须使用荧光检测专用的黑色96孔板。
使用方法
探针染色工作液配制：
1. 根据样本数量，用HBSS将BBoxiProbe® O69荧光染料500倍稀释，配制成染色工作液。
O69探针标记：
1. 准备1 ml新鲜待测菌液。
2. 将待测细菌样本离心收集菌体。
3. 用PBS洗涤菌体2-3次。离心收集菌体沉淀。
4. 用500 μl染色工作液重悬菌体。
5. 在37℃避光孵育30分钟。
6. 孵育结束后，离心收集菌体。
7. 用PBS清洗细胞一次。离心收集菌体。
8. 用500 μl PBS重悬菌体。充分混匀。
9. 取200 μl加入荧光检测用96孔板。
10. 置于荧光光度计或酶标仪中，后于激发波长为640 nm、发射波长670 nm检测荧光强度。
参考文献
1. Yuzhi Chen et al.
Mitochondria-Targeted Polydopamine Nanocomposite with AIE Photosensitizer for Image-Guided Photodynamic and Photothermal Tumor Ablation
Small 2019 （IF=11.459）

2. Yinghui Shang et al.
Zirconia Nanoparticles Induce HeLa Cell Death Through Mitochondrial Apoptosis and Autophagy Pathways Mediated by ROS
Frontiers in Chemistry 2021 （IF=3.693）
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